基于先進技術的優化策略對于最大化產量和質量至關重要。
貼壁細胞培養至少在小規模上被廣泛用于生產許多下一代療法，包括用于基因和基因修飾細胞療法的病毒載體以及非基因修飾的細胞療法。隨著對這些先進藥物的需求迅速增加，需要克服貼壁生產過程的橫向擴展和放大的挑戰，包括細胞收獲步驟 - 無論細胞是被丟棄還是作為產品收集。
許多不同的貼壁方法和產品類型
FUJIFILM Diosynth Biotechnologies 的項目設計和全球分析策略組的項目設計總監 Ian Goodwin 表示，用于生產生物制藥產品的貼壁細胞培養可以通過多種方式用于許多不同類型的生物制品。單克隆抗體 (mAb)、重組蛋白和大多數病毒載體在懸浮培養中生長，通常不需要收集細胞。對于分泌到培養基中的產物，收集上清液并丟棄細胞。如果產物不被分泌或既被內化又被分泌，則必須首先裂解細胞、以釋放產物，然后收集裂解物。在這兩種情況下，收集的生物工藝流體都經過過濾，通常是深層過濾，然后是除菌過濾。
顧名思義，貼壁細胞需要它們可以附著的基質或支架。在小規模條件下，平面系統提供了相關的表面。在更大規模上，固定床生物反應器提供了支持。如果傾向于懸浮樣條件，可以使用微載體或由各種合成材料組成的基球作為細胞結合的表面。
兩種主要的收獲方法
無論用于支持貼壁細胞的方法和工藝的規模如何，細胞都必須與其支持物分離。Univercells Technologies 產品經理 Clément Dumont 表示，通用原則適用于不同應用的所有細胞分離操作。“無論細胞是用于生產生物制品還是直接用作最終產品，分離過程都將涉及將細胞暴露于酶促和潛在的機械作用。該過程的特殊性將取決于不同的考慮因素，主要是細胞的類型、它們的預期用途以及操作執行的規模，”他解釋道。
例如，用于小規模研發實驗的 T 瓶中的人胚腎 293 (HEK293) 細胞培養通常可以通過遵循一系列簡單的操作來分離：移除培養基，添加分離酶并孵育，然后收集細胞，Dumont 說。典型的酶包括胰蛋白酶或 Accutase (Invitrogen)。在傳代步驟中，通常通過手動搖動燒瓶（機械作用）來輔助細胞收集。
對于大多數大規模、基于多層培養器皿的工藝，通常采用酶促收獲。Samsung Biologics 制造、科學和技術上游工藝團隊的首席科學家 Lee Seung-sun 指出，由于物理方法不適用，因此這種方法還用于從微載體和固定床生物反應器中去除貼壁細胞。“在收集用作細胞療法的細胞時必須特別小心，以避免損壞細胞膜和細胞外基質，即使在使用酶促工藝時也是如此，因為某些酶會降解這些重要的細胞特征，”他補充道。
然而，當放大規模時，必須復制與研發規模相同的行動，但表面積要大得多。Dumont表示，這會增加復雜性。“例如，從 40 層細胞工廠 (CF40) 中分離細胞可能需要專門的設備來處理流體和容器或施加機械作用。當涉及大量容器時，這些特殊要求可能變得不切實際，”他爭辯道。
微載體呈現出不同的情況。“細胞和微載體可能經過化學處理，如果微載體不溶，混合物會通過篩網分離細胞。如果微載體可以用果膠酶溶解，用這種酶處理可以釋放細胞進行進一步工藝處理，”FUJIFILM Diosynth Biotechnologies 病毒基因治療工藝開發高級總監 Michael Baker 觀察到。
根據 Goodwin 的說法，在某些情況下，細胞療法在類似貼壁的條件下生長，但細胞附著有些松散，從而無需使用解離試劑。他還強調，隨著項目從臨床前階段進入商業階段或規模，關鍵工藝參數和細胞收獲的設計空間可能會發生變化；即便如此，Goodwin 建議盡可能避免對收獲方法進行任何更改。
規模擴展的挑戰
需要貼壁培養的細胞類型在規模放大和收獲方面遇到挑戰，而這些可能不會影響懸浮培養。鑒于可以在平面器皿中進行貼壁細胞培養的最大規模是有限的，因此需要橫向規模擴展而不是放大來生產更大的產品數量，特別是對于表達型產品。Baker 評論道：“橫向擴展的流程需要更多的勞動密集型工作，需要更多的空間、時間和人員，可能會危及產品質量。”
事實上，在扁平器皿中運行的細胞培養工藝無法實現自動化并且涉及大量手動操作，這也意味著制造商需要經驗豐富且技術嫻熟的細胞科學家，他們可以幫助減少復雜收獲工藝實施過程中出錯的可能性，Seung-sun稱。
“目前，高效的培養容器無法用于貼壁細胞培養的生產和收獲。雖然可以使用多層培養工廠，但它們存在一些限制，例如細胞增殖的最小表面積。由于缺乏高效的培養容器，收集此類細胞仍然需要 CO2 培養箱和人工操作的幫助，”Seung-sun 補充道。
Seung-sun 繼續指出，值得注意的是，當前制造的大多數細胞治療產品（即嵌合抗原受體 T 細胞、間充質干細胞）都是自體的、針對患者的療法，可以小規模生產。此外，Baker 指出，使用貼壁細胞培養產生的許多治療方法都針對極罕見的適應癥，在這些適應癥中，商業規模生產不需要顯著擴大規模，因此，2D培養方式可能是生產藥物底物的可行方式。
同樣，典型細胞治療應用所需的細胞數量低于生產其它生物藥所需的細胞數量。根據 Goodwin 的說法，對于這些產品，挑戰就變成了需要在封閉的一次性系統中生產它們，以最大限度地減少生產過程的無菌性挑戰并降低污染風險。
規模放大的阻礙
雖然自體細胞療法在當今市場占據主導地位，但許多候選藥物都是同種異體或供體來源的。因此，Seung-sun 認為，有效擴大貼壁細胞培養工藝的能力對于未來細胞療法的商業化至關重要。
對于確實需要規模放大的工藝，Baker指出，固定床生物反應器試圖通過使用有利于細胞生長的復雜纖維基質或支架將表面積集中到一個單元中來克服放大問題。同時，微載體可以使用攪拌罐反應器和類似懸浮培養的條件。“這些屬性使 3D 反應器和微載體成為貼壁細胞系產品的良好選擇，這些產品旨在治療更大的患者群體和/或需要更大體積的細胞，”他總結道。
然而，規模放大并非沒有問題。表達在貼壁細胞內部的產物需要細胞收集。Baker 表示，在孔板和培養皿等非常小規模的環境中，可以對細胞進行機械操作（刮擦）并以非常高的效率進行收集。
較大的固定床生物反應器也必須接種細胞。對于種子擴增鏈操作，Dumont 強調，生成足夠的細胞數量所需的扁平器皿單元數量不斷增加，這造成了操作限制。“需要大型設備和相關勞動力來操縱大量裝置，導致大量 CAPEX [資本支出] 和 OPEX [運營費用]，同時還需要更多手動（非自動）操作，這會增加污染風險和低再現性，“ 他說。大收獲體積也可能是一個挑戰。“在下一步之前可能需要進一步處理和濃縮細胞，這對于種子培養操作來說尤其成問題，因為在整個過程中需要多次傳代，”Dumont 評論道。
Dumont 表示，與此同時，使用微載體的工藝可能難以轉移，而且往往需要更多優化才能在大規模條件下實現合適的工藝。“剪切應力和基球聚集是需要解決的常見缺點。這些生物反應器的體積很大，導致占地面積也很大，”他說。
此外，Baker 觀察到，化學釋放劑必須從最終產品基質中去除，因為它們被認為是與工藝相關的雜質。他還指出，當使用微載體在懸浮體系中培養貼壁細胞時，還應考慮溶解微載體或提取微載體的溶出 & 析出問題。
最后，Seung-sun 指出，目前的固定床生物反應器較難對細胞進行取樣并獲得有關細胞狀況、代謝變化或活細胞數量的直接分析數據。“充其量，可以根據培養基中的葡萄糖濃度來估計活細胞的數量，”他解釋道。
一些優化策略
貼壁細胞培養工藝的幾乎所有方面都可以通過某種方式進行優化。首先，根據 Dumont 的說法，可以優化分離過程，以考慮具有不同屬性和行為特征的不同類型的細胞，這些細胞在脆弱性/抗降解、聚集等方面具有不同的特性和行為特征。這種優化將導致對酶、孵育時間和機械作用水平的不同選擇。“選擇用于將該工藝過程工業化的技術至關重要。需要在快速且簡單的操作與適應各種工藝類型的靈活性之間找到良好的平衡，”他說。
Seung-sun 觀察到，優化用于細胞分離的酶處理工藝的條件也是一個重要的策略。“研究濃度、時間和溫度，以及最大化培養容器與酶的接觸面積，有助于最大限度地減少細胞損傷并提高收獲收率，”他說。Goodwin 補充說，實驗設計方法有利于優化細胞裂解和去除裂解試劑（通過各種純化步驟）。
對于作為治療產品的細胞，除了使用封閉環境來確保無菌性和降低污染風險之外，Goodwin 觀察到任何破壞細胞附著的過程都必須針對細胞的釋放進行優化，同時最大限度地減少結構完整性受損的細胞，這可能會影響細胞治療產品的功效、效力和/或安全性。
技術發展的幫助
生物制藥行業雖然保守，但在創新方面有其基礎。細胞收獲操作受益于不斷提高性能和降低生物藥生產成本的行業趨勢。Baker 表示，新的化學解離試劑和物理分離方法不斷被開發和推出，以幫助研究人員改進細胞收獲程序。他補充說，最近還引入了平皿自動化程序，可以將細胞培養和細胞收獲步驟的勞動密集型程序減少 30-50%。
Seung-sun 重點介紹了新的培養設備，例如 Wilson Wolf 的 G-Rex、Terumo 的 Quantum、Lonza 的 Cocoon 和 Miltenyi Biotech 的 CliniMACS 系統，但他確實指出，大多數這些“cell-therapy-in-a-box”解決方案都設計用于支持懸浮細胞培養。與此同時，Univercells Technologies 專注于通過能夠實現工藝強化和鏈接化的技術，來改進病毒載體的生產。
Dumont 指出，該公司最近的工作是開發了一種有效的解決方案，用于從其臺式規模的 scale-X 固定床生物反應器中收獲細胞，以支持優化的種子培養。“臺式 scale-X 細胞收獲模塊允許在固定床生物反應器中強化細胞生長，顯著提高工藝強化，減少占地面積和所需的操作，”他說。Dumont 表示，機械作用可提供高細胞收獲率（高達 2.1x10^9 cells/m2）和出色的活性 (>90%)。“自動控制系統支持可配置的收獲方案，預消毒的封閉系統降低了與平皿系統相關的可重復性和無菌風險問題，同時還降低了材料和人工成本，”他補充道。
未來的希望是實現封閉、自動化工藝
最后，Dumont 強調，成功的細胞收獲取決于特定的工藝和為該工藝的工業化而選擇的技術。“生產平臺需要支持快速和簡單的操作，同時提供適應各種工藝類型的靈活性，”他說。
預計技術將繼續進步。Goodwin 指出了改進的細胞收獲解決方案，可以最大限度地提高細胞回收率，尤其是在封閉系統中。“要么細胞收獲程序將繼續發展、以支持大規模工藝，要么培養容器將專門針對細胞收獲目的而進行設計，”他評論道。
Goodwin 表示，向封閉系統的轉變將繼續，自動化控制的采用也將增加 - 這既是為了減少操作員錯誤和污染的風險，也是為了最大限度地減少生產批次之間的操作差異。他說，這些進步也將有助于降低生產成本。
另外，Seung-sun 預計細胞治療市場將逐漸轉向懸浮細胞培養。“與懸浮培養相比，貼壁細胞培養效率低得多。工業生物藥生產方面取得的進展為下一代治療產品的類似改進提供了動力，”他說。一項可能促進這種轉變的技術是一次性 3D 垂直輪生物反應器，Goodwin 指出，該技術已被證明可成功用于將貼壁細胞轉化為懸浮生長模式，使用或不使用微載體。
Dumont 表示同意，擺脫橫向規模擴展的手動細胞培養和收獲將從根本上改變此類操作的范式。“為細胞培養和收獲選擇一個封閉、自動化的解決方案可以降低操作風險并顯著降低成本。最終，這將提高行業的質量和成本效益，”他總結道。
總的來說，Baker堅持認為應該強調前瞻性、可擴展的選擇。“對于生物制藥和細胞治療應用，貼壁或貼壁樣培養應使用減少無菌邊界的技術，并結合最新的生產污染控制策略。緊跟行業趨勢和技術發展將帶來更多的生產批次成功（更少的損失），通過自動化實現更高效的運營，并減少對產品完整性的安全擔憂，”他總結道。
原文：Challener, C. Overcoming Harvesting Challenges for Adherent Cell-Culture Processes. BioPharm International 2023 36 (5).
