腺相關病毒：簡史
腺相關病毒 (Adeno-associated virus, AAV) 是一種無囊膜的T=1二十面體病毒，屬于細小病毒科依賴病毒屬。所有細小病毒都具有線性單鏈DNA基因組，兩側是作為DNA合成起點的反向末端重復序列 (ITR)。AAV基因組編碼兩個主要的基因“盒”，由三個啟動子調控：p5和p19調控編碼非結構蛋白的rep基因的表達，p40調控編碼結構病毒顆粒蛋白 (VP1、VP2和VP3) 的cap基因的表達。rep和cap轉錄本都利用一個共同的多聚腺苷化信號。其它基因產物也被描述為由其它開放閱讀框編碼，例如裝配激活蛋白 (AAP)。獨特的是，AAV需要與“輔助”病毒 (如腺病毒(AdV) 或單純皰疹病毒(HSV)) 共同感染才能生產性感染。
AAV最早是在20世紀60年代通過電子顯微鏡發現的，是腺病毒制劑中的污染物。隨后的研究表明，與AAV血清學相關的病毒在人類中廣泛傳播。在沒有輔助病毒的情況下的感染還沒有記錄，同時感染 (如AAV和Ad) 引起的疾病并不比單獨感染Ad更嚴重，因此AAV被認為是非致病性的。
由于AAV在病原學上不被認為是病原體，因此AAV的研究活動最初僅限于少數實驗室。AAV遺傳的流線型特性，以緊湊、最小的病毒基因組為特征，促進了分子遺傳分析，并為研究細胞途徑和病毒-細胞相互作用提供了一個多功能平臺。Muzyczka實驗室的突破性研究表明，病毒基因可以被非病毒基因取代，例如報告基因或僅保留非編碼ITR序列的治療基因。這些初步報告表明，這種重組AAV結構可以作為基因遞送載體，能夠“轉導”分裂細胞和非分裂細胞 (即轉基因基因表達)。這些發現激發了人們對AAV基因治療應用的興趣。
將病毒基因組整合到宿主細胞基因組中并不是細小病毒復制的必然步驟，這對于一些已適合用作基因載體的其它病毒組而言是必需的，即逆轉錄病毒（逆轉錄病毒科）。然而，野生型 (wt) 或重組 AAV 的病毒顆粒 DNA 可能通過細胞介導的過程進行整合：wtAAV 有整合到 AAVS1 中的傾向，AAVS1 是人類 19 號染色體上的一個確定位點，而缺乏rep基因產物的重組AAV的整合是隨機發生的，并且在基因組位置方面既罕見又相對不加區別。然而，有報道稱病毒載體整合位點偏向載體和染色體 DNA 之間的（微觀）同源區域，并且 AAV ITR 和 AAVS1 的序列相似性可能導致整合出現偏差。
AAV-5 的發現、分離和流行病學
目前，三種天然存在的 AAV 正在開發用于大多數基因治療應用：AAV-2、AAV-5 和 AAV-9。分配給這些 AAV 分離株的數字名稱有歷史依據：繼 1965 年首次發現 AAV 之后，從細胞培養制劑、組織樣本和圈養獼猴中獲得了具有不同抗原特性的其它 AAV 分離株。為了區分這些抗原性不同的 AAV，建立了基于血清學的命名系統。該系統根據 AAV 的分離順序為它們分配數字名稱，稱為“血清型”（迄今為止，至少已識別出 12 種自然存在的血清型）。然而，此后已確定 AAV-5 實際上代表一種獨立的病毒物種，名為“哺乳動物依賴細小病毒 1”。另一方面，所有其它 AAV 分離株都是另一種 AAV 物種“靈長類依賴細小病毒 1”的變種。
AAV-5 是由 Ursula Bantel-Schaal 博士和 Harald zur Hausen 博士于 1984 年在德國海德堡的德國癌癥研究中心（Deutsches Krebsforschungszentrum 或 DKFZ）發現的。該病毒是從生殖器軟骨瘤標本中臨床分離出來的，并顯示在腺病毒共感染的情況下可以感染培養中的人類細胞。將一份受感染細胞培養上清液提供給美國國立衛生研究院 (NIH)，Kotin 實驗室成員對病毒基因組進行分子克隆和測序。 Chiorini 等人證明重組 rAAV-5 載體具有生物活性，因此可將 AAV-2 載體基因組“反殼化”到細胞中。由于每種病毒之間的基因組差異，特別是 (i) ITR 序列和 (ii) Rep 蛋白識別序列基序，這一發現是出乎意料的。雖然之前的 AAV 基因治療載體僅限于 AAV-2 衣殼，但使用來自更遠親的分離血清型（包括 AAV-4 和 AAV-5）的衣殼創建載體的能力建立了不同 AAV 分離株的“可載體性”。這些結果是 AAV 載體學領域的基礎性發現。
在非臨床研究中，AAV-5 載體已證明可以有效轉導各種組織類型，包括肺、肝、肌肉和腦組織。目前，兩種利用AAV-5的基因治療產品已獲得監管部門的批準，分別是uniQure針對B型血友病開發的Hemgenix?（FDA批準）和BioMarin針對A型血友病開發的Roctavian?（EMA批準）。其它基于 AAV-5 的基因療法也正在開發中，用于治療其它遺傳疾病，包括肌營養不良癥、血友病和遺傳性視網膜疾病。此外，研究正在進行中，以探索 AAV-5 載體向大腦遞送治療基因的潛力，目標是治療帕金森病和阿爾茨海默病等神經系統疾病。
盡管rAAV在基因治療中很受歡迎，但對人類AAV感染的自然生物學和流行病學的了解仍然非常有限。然而，基于血清學和基因測序的研究提供了明確的證據，表明靈長類依賴細小病毒1在人群中自然傳播。相比之下，依賴細小病毒哺乳動物1（即AAV-5）在人類中自然循環的證據主要基于血清學數據?？傮w而言，AAV-5 特異性抗體的流行率似乎低于其它 AAV 血清型，并且不同人群之間似乎存在差異。
圖1. 腺相關病毒的進化關系。自舉系統發育樹（1000 個重復）顯示了腺相關病毒 (AAV) 分離株之間重建的進化關系。該樹是根據跨越rep基因的393個核苷酸的比對構建的，使用RAxML中實現的最大似然和核苷酸替換的一般時間可逆模型。星號表示引導程序支持 >70% 的節點。比例尺表示每個位點替換的進化距離。動物剪影表明宿主物種關聯。大多數 AAV 血清型，包括 AAV-1 至 AAV-4、AAV-6 至 AAV-12，似乎代表了靈長類動物特異性的多樣性，并且是單一物種“靈長類依賴細小病毒 1”的成員（由粉紅色括號表示）。盡管這些病毒與靈長類動物有關，但它們與個別靈長類動物的關系尚不確定，因此輪廓顯示在括號右側。然而，它們與猿猴靈長類動物的長期關聯通過在猿猴基因組中插入約 2000 萬年前的內源細小病毒元件 (EPV) (EPV-Dependo.13) 得到證明，該元件在以下物種的多樣性中穩健分組：靈長類動物依賴細小病毒1。與從靈長類動物樣本中獲得的所有其它 AAV 不同，AAV-5（以紅色表示）在有蹄類動物病毒的多樣性中表現強勁，并且與山羊 AAV 關系尤其密切。
AAV-5 的非靈長類起源
已發現許多非靈長類哺乳動物物種是依賴細小病毒的宿主，包括蝙蝠、嚙齒動物、食肉動物和有蹄類動物。雖然其中一些病毒，例如牛腺相關病毒 (BAAV)，早在 20 世紀 70 年代就被發現了，但它們的基因組序列直到許多年后才被表征。然而，當最終獲得有蹄類 AAV（包括 BAAV 和“山羊腺相關病毒”（CAAV））的基因組序列時，意外地發現這些病毒物種與 AAV-5 具有密切的進化關系。這些發現表明跨物種轉移可能已經發生。
直到最近，由于缺乏有關 AAV 自然生態和多樣性的信息，因此很難從 AAV 系統發育中得出有關跨物種轉移方向性的可靠結論。然而，自 2000 年代中期以來，病毒基因組測序的巨大進步極大地擴展了我們對病毒多樣性的理解，從而可以更可靠地推斷宿主與細小病毒的關系。目前的數據表明，AAV 很少在親緣關系較遠的哺乳動物群體之間傳播。因此，對 AAV 分離株之間觀察到的系統發育關系最簡潔的解釋是 AAV-5 是否起源于有蹄類動物。
通過宿主物種基因組測序揭示了有關宿主與細小病毒關系的更多信息。這表明源自細小病毒（包括 AAV）的 DNA 序列廣泛存在于動物物種的種系基因組中。這些序列被稱為“內源性細小病毒元件”（EPV），通常已有數百萬年的歷史，很可能起源于源自古代細小病毒的 DNA 被整合到祖先宿主物種的種系中時。 EPV 為細小病毒與宿主物種之間的長期共同進化關系提供了獨特的見解。 EPV 和當代細小病毒的系統發展表明，在 獼猴靈長類動物中發現的一些 EPV 來自約 1600-2300 萬年前傳播的當代靈長類 AAV 的古代祖先（圖 1）。這些發現表明，AAV 譜系與宿主群體具有穩定、長期的關聯，進一步支持 AAV-5 起源于有蹄類動物的觀點。
理論上，AAV-5 有蹄類動物向人類傳播至少有兩種可能發生的情況。一種常見的情況是生物制藥產品無意中受到污染，這可能會導致人類感染。 AAV 是眾所周知的細胞和病毒培養系統污染物，并且存在多種可能的污染源。其中，來自有蹄類動物的生物材料，例如胎牛血清（FBS），是最有可能的來源。數十年來，FBS 已廣泛用于哺乳動物細胞培養，并被認為是外源因子的潛在來源。過去，胎牛血清處理依賴于除菌過濾，這不能消除病毒顆粒。然而，如果 FBS 受到污染，則可能會在多個細胞培養設施中檢測到 AAV5 的存在。
另外，由于 AAV5 是從生殖器軟骨瘤中分離出來的，因此它在人類中的存在可以通過性接觸來解釋。由于人類與有蹄類動物密切接觸已有數千年，而且 AAV-5 在人群中的血清流行率相對較低，因此跨物種傳播可能只會在異常情況下發生。與流行的傳說相反，通過動物戀行為發生病毒人畜共患傳播的記錄實例很少。然而，在這種特殊情況下，可以合理地認為此類行為發揮了作用。獲得并檢查與獲得 AAV-5 的軟骨瘤相關的乳頭瘤病毒基因組序列可能很有趣，以確定這些序列是否屬于人類中常見的病毒基因型，而不是有蹄類動物中發現的病毒基因型。
在圖2中，我們提出了 AAV-5 出現和流行病學的四種替代模型，每種模型都是根據 (i) 跨物種傳播頻率和 (ii) 人際傳播程度的差異來定義的。如果 AAV-5 血清學準確反映了 AAV-5 感染的血清轉化，那么人群中的流行率可能反映了人與人之間的傳播（或藥物的大規模污染）。如果血清陽性是由交叉反應抗體（即靈長類 AAV 和 AAV-5 之間的共同表位）引起的，那么這兩種 AAV 的血清陽性率預計將高度相關。也許開發提高衣殼特異性和減少交叉反應性的檢測方法將有助于解決血清陽性率的不確定性。盡管 AAV-2 和 AAV-5 的主要外殼蛋白 (VP3) 僅具有約 60% 的同一性，但基于線性和結構預測分析的表位預測表明存在幾個常見表位。接觸 AAV-2 或其它靈長類 AAV 可能產生交叉反應抗體，這意味著衣殼結合抗體無法確定 AAV-5 血清陽性率。
圖2 人類AAV-5出現模型。顯示 AAV-5 出現的替代模型的矩陣。這些模型是根據以下方面的差異來定義的：(i) 跨物種傳播的頻率，以及 (ii) 人際傳播的程度。在模型 (i) 中，跨物種傳播是一種罕見事件，不會繼續傳播 - 在這種情況下，報告的 AAV-5 血清陽性即使不是人為的，也必然通過人類接觸受污染的生物藥品而發生。在模型 (ii) 中，AAV-5 的人際傳播確實經常發生，并且所有 AAV-5 分離株均源自少數跨物種傳播事件，可能不超過一次。該模型可以在不使用受污染的生物藥品的情況下解釋人類中的 AAV-5 血清陽性，但這意味著它應該有一個明確的分布，在暴露人群中患病率更高。在模型（iii）中，跨物種傳播發生得更頻繁，但人際傳播則不然。在此模型中，AAV 5 血清陽性預計僅發生在直接從有蹄類動物或通過受污染的生物藥品感染病毒的個體中。在模型（iv）中，跨物種傳播發生得更頻繁，其中許多事件導致人與人之間的傳播。這可以解釋在不涉及受污染的生物藥品的情況下，人群中 AAV-5 血清陽性率高的原因，但這違背了進化論的預期，因為最近通過人畜共患病獲得的病毒被認為通常在受體宿主物種中具有較低的傳播性。
總結
如果如血清學研究表明的那樣，AAV-5 感染確實在人群中廣泛存在，那么這就提出了幾個重要問題。首先，人類感染 AAV-5 是最近才出現的，還是前幾年沒有被發現？考慮到人類和家養有蹄類動物之間長期存在的相互作用，跨物種傳播可能會更早發生。其次，如果確實發生人際傳播，AAV-5是否適應了人類宿主？此外，關于 AAV-5 感染的自然途徑和體內目標組織也存在問題。對自然循環的 AAV-5 多樣性進行小規模、基于序列的探索可以闡明其中許多問題，并提供回答其它問題的途徑。
原文：R.J.Gifford, R.M.Kotin, Unraveling the origins of human adeno-associated virus 5. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(4), 265–273.
